第一部分 临床和诊断病毒学
第一章  基孔肯雅病毒进化和流行病学
  1.1  引言
  1.2  病毒的传播循环和媒介
  1.3  病毒的历史和起源
  1.4  2004年以来基孔肯雅病毒的流行病学和感染传播情况
  1.5  基孔肯雅病毒在西半球的感染情况
  1.6  结语
  参考文献
第二章  基孔肯雅病毒分子流行病学
  2.1  引言
  2.2  材料
    2.2.1  病毒RNA的提取
    2.2.2  一步法反转录-聚合酶链反应(One-step RT-PCR)
    2.2.3  聚合酶链反应(PCR)产物的琼脂糖凝胶电泳和纯化
    2.2.4  测序反应
    2.2.5  PCR测序产物的纯化
  2.3  方法
    2.3.1  病毒RNA的提取
    2.3.2  一步法RT-PCR
    2.3.3  琼脂糖凝胶电泳和纯化PCR产物
    2.3.4  测序反应
    2.3.5  纯化循环测序产物
    2.3.6  测序数据编辑
    2.3.7  系统发育树的构建
  2.4  注释
  参考文献
第三章  高级遗传方法学在基孔肯雅病毒进化和传播追踪溯源研究中的应用
  3.1  引言
  3.2  材料
  3.3  方法
    3.3.1  序列生成
    3.3.2  从公共数据库获得序列
    3.3.3  多序列比对
    3.3.4  序列多态性和基因突变分析
    3.3.5  中值连接进化网络的构建
    3.3.6  生成一个时间尺度的贝叶斯系统发育树,并通过BEAST软件包计算目标序列到最近的共同祖先的时间(tMRCA
)
以确定祖先的年代
    3.3.7  BEAST跟踪输出的可视化
    3.3.8  用BEAST系统发育树输出方式构建最大分支可信度树
    3.3.9  一致最大分支可信度树的可视化
    3.3.10  通过BEAST2软件进行系统地理学分析来确定病毒株时空传播特点
    3.3.11  用SPREAD软件使系统地理学输出可视化
  3.4  注释
  参考文献
第四章  基于合成肽的抗体检测方法诊断有无神经系统并发症的基孔肯雅病毒感染
  4.1  引言
  4.2  材料
    4.2.1  单向电泳
    4.2.2  双向电泳
    4.2.3  电洗脱
    4.2.4  液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)分析
    4.2.5  多肽合成
    4.2.6  酶联免疫吸附试验(ELISA)
  4.3  方法
    4.3.1  单向电泳
    4.3.2  双向电泳
    4.3.3  电洗脱
    4.3.4  蛋白液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)分析
    4.3.5  多肽合成
    4.3.6  酶联免疫吸附试验(ELISA)
  4.4  注释
  参考文献
第五章  E2糖蛋白在Sf9昆虫细胞的表达和纯化及其在血清学中的应用
  5.1  引言
  5.2  材料
    5.2.1  昆虫表达组件的构建
    5.2.2  Sf9细胞的维持及E2糖蛋白的瞬时表达
    5.2.3  在昆虫细胞中稳定表达E2糖蛋白
    5.2.4  稳定表达细胞的冻存
    5.2.5  自然分泌CHIKV-E2的纯化
    5.2.6  基孔肯雅病毒的血清学诊断
  5.3  方法
    5.3.1  构建昆虫表达组件
    5.3.2  Sf9细胞的维持和E2糖蛋白的瞬时表达
    5.3.3  E2糖蛋白在昆虫细胞中的稳定表达
    5.3.4  稳定细胞的低温保存
    5.3.5  纯化自然分泌的CHIKV-E2蛋白
    5.3.6  CHIKV的血清学诊断
  5.4  注释
  参考文献
第六章  基于血清学工具的CHIKV感染诊断方法
  6.1  引言
  6.2  材料
  6.3  方法
    6.3.1  血清样品的准备
    6.3.2  血清和病毒混合液的准备
    6.3.3  细胞培养
    6.3.4  用中和过的病毒感染细胞
    6.3.5  计算结果
  6.4  注释
  参考文献
第七章  使用咽拭子及尿液标本诊断基孔肯雅病毒感染及其评价
  7.1  引言
  7.2  材料
    7.2.1  病毒检测
    7.2.2  ELISA检测IgM抗体
    7.2.3  体外病毒分离
    7.2.4  体内病毒分离
  7.3  方法
    7.3.1  通过分子生物学技术和测序分析检测病毒基因组
    7.3.2  IgM抗体捕获-ELISA血清学检测
    7.3.3  体外病毒分离
    7.3.4  体内病毒分离
  7.4  注释
  参考文献
第二部分 细胞培养?病毒复制和细胞反应
第八章  用蚊子细胞扩增基孔肯雅病毒
  8.1  引言
  8.2  材料
    8.2.1  培养C6/36细胞
    8.2.2  病毒扩增
  8.3  方法
    8.3.1  培养C6/36细胞
    8.3.2  病毒扩增
  8.4  注释
  参考文献
第九章  基孔肯雅病毒感染的定量分析——病毒蚀斑试验
  9.1  引言
  9.2  材料
  9.3  方法
    9.3.1  收集用于蚀斑试验的样本
    9.3.2  接种BHK-21细胞于24孔板
    9.3.3  蚀斑试验
  9.4  注释
  参考文献
第十章  实时RT-PCR检测与定量分析基孔肯雅病毒
  10.1  引言
  10.2  材料
    10.2.1  寡核苷酸序列
    10.2.2  病毒RNA提取
    10.2.3  常规RT-PCR
    10.2.4  PCR产物的琼脂糖凝胶电泳及纯化
    10.2.5  体外转录合成cDNA
    10.2.6  一步法SYBR Green I实时RT-PCR
    10.2.7  一步法TaqMan实时RT-PCR
  10.3  方法
    10.3.1  病毒RNA提取
    10.3.2  体外转录PCR产物的制备
    10.3.3  琼脂糖凝胶电泳及PCR产物纯化
    10.3.4  体外转录
    10.3.5  RNA转录物的纯化
    10.3.6  总RNA产量的计算
    10.3.7  体外转录RNA拷贝数测定
    10.3.8  用于RNA绝对定量的标准品构建
    10.3.9  基于SYBR-Green I的实时RT-PCR的绝对定量
    10.3.10  基于TaqMan的实时RT-PCR的绝对定量
    10.3.11  定量未知样本中CHIKV载量
  10.4  注释
  参考文献
第十一章  伊蚊的基孔肯雅病毒感染
  11.1  引言
  11.2  材料
    11.2.1  含CHIKV的血液(CHIKV血饲)
    11.2.2  蚊子感染
    11.2.3  从蚊子收集CHIKV
    11.2.4  处理采集的蚊子脏器
  11.3  方法
    11.3.1  准备含病毒的血食物
    11.3.2  蚊子感染
    11.3.3  采集和处理受感染蚊虫的脏器
    11.3.4  处理采集的蚊虫组织器官
  11.4  注释
  参考文献
第十二章  人工血食物感染蚊虫中CHIKV的分析
  12.1  引言
  12.2  材料
    12.2.1  蚊子的饲养
    12.2.2  制备含感染性CHIKV的血食物
    12.2.3  感染后蚊子的处理
    12.2.4  核酸的检测与定量
  12.3  方法
    12.3.1  埃及伊蚊和白纹伊蚊群落的饲养
    12.3.2  蚊子感染性血饲流程
    12.3.3  暴露后蚊子处理:通过分析CPE检测蚊子中的病毒
    12.3.4  暴露后蚊子处理:强迫唾液分泌
    12.3.5  CHIKV核酸检测与定量
  12.4  注释
  参考文献
第十三章  基孔肯雅病毒生长与荧光标记:免疫荧光法检测基孔肯雅病毒
  13.1  引言
  13.2  材料
    13.2.1  病毒生长
    13.2.2  荧光显微镜
    13.2.3  使用IFA进行血清学诊断
    13.2.4  流式细胞术
  13.3  方法
    13.3.1  细胞生长
    13.3.2  荧光显微镜下确定病毒的生长
    13.3.3  应用IFA进行血清学诊断
    13.3.4  流式细胞术测定病毒生长
  13.4  注释
  参考文献
第十四章  用蔗糖密度梯度分离和制备基孔肯雅病毒样本用于透射电镜观察
  14.1  引言
  14.2  材料
    14.2.1  CHIKV的分离与扩增
    14.2.2  病毒纯化
    14.2.3  负染色和免疫金标记法
  14.3  方法
    14.3.1  分离CHIKV
    14.3.2  CHIKV滴定
    14.3.3  大规模扩增CHIKV用于病毒纯化
    14.3.4  聚乙二醇(PEG沉淀)纯化病毒
    14.3.5  不连续的蔗糖梯度纯化病毒
    14.3.6  负染法
    14.3.7  免疫胶体金标记
  14.4  注释
  参考文献
第十五章  酵母双杂交筛选法研究病毒-宿主蛋白的相互作用
  15.1  引言
  15.2  材料
    15.2.1  GAL4 Y2H系统中使用的酵母菌株和质粒
    15.2.2  培养基
    15.2.3  酵母转化
    15.2.4  准备酵母蛋白提取物
    15.2.5  BD病毒融合构建物自激活的检测
    15.2.6  病毒-宿主相互作用文库的筛选
    15.2.7  酵母菌落PCR
    15.2.8  多重库质粒的排除
    15.2.9  限制性消化排除重复文库质粒
    15.2.10  从酵母中分离捕获质粒DNA
    15.2.11  大肠杆菌细胞中酵母质粒的转化
    15.2.12  细菌菌落PCR
    15.2.13  分离大肠杆菌DH5α细胞中的质粒DNA
  15.3  方法
    15.3.1  酵母细胞的小量转化
    15.3.2  准备酵母蛋白提取物
    15.3.3  自激活分析
    15.3.4  酵母双杂交文库筛选
    15.3.5  酵母菌落PCR
    15.3.6  消除多重库质粒
    15.3.7  限制性酶切消除重复文库质粒
    15.3.8  从酵母中分离捕获质粒DNA
    15.3.9  酵母质粒转化大肠杆菌(DH5α)
    15.3.10  细菌克隆PCR和质粒DNA分离
    15.3.11  测序分析
  15.4  注释
  参考文献
第十六章  GelC-MS/MS在基孔肯雅病毒感染蛋白质组分析中的应用:制备用于分析的肽段
  16.1  引言
  16.2  材料
    16.2.1  蛋白制备及定量
    16.2.2  SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)
    16.2.3  凝胶染色和脱色(考马斯亮蓝)
    16.2.4  凝胶染色和脱色(银染)
    16.2.5  凝胶处理
    16.2.6  蛋白分析
  16.3  方法
    16.3.1  样品制备(在组织培养板或培养瓶中培养的细胞)
    16.3.2  标本制备(临床材料:白细胞)
    16.3.3  Lowry法测定蛋白浓度
    16.3.4  十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
    16.3.5  凝胶染色和脱色(考马斯亮蓝)
    16.3.6  凝胶染色和脱色(银染)
    16.3.7  还原/烷基化和凝胶内酶切消化
  16.4  注释
  参考文献
第十七章  生物信息学方法研究基孔肯雅病毒感染过程中病毒与宿主的相互作用
  17.1  引言
  17.2  方法
    17.2.1  病毒蛋白结构
    17.2.2  鉴定基孔肯雅病毒和宿主的结构相似蛋白
    17.2.3  CHIKV与宿主蛋白相互作用的预测
    17.2.4  基因聚类与相互验证
    17.2.5  结果解释
  17.3  注释
  参考文献
第十八章  基孔肯雅病毒T细胞表位预测
  18.1  引言
  18.2  材料
    18.2.1  数据
    18.2.2  软件
  18.3  方法
    18.3.1  结合物和非结合物的定义
    18.3.2  肽序列转化为特征性载体
    18.3.3  预测模型的建立
    18.3.4  预测模型的评价
    18.3.5  CHIKV T细胞表位的预测
  18.4  注释
  参考文献
第三部分 免疫学和动物模型研究
第十九章  基孔肯雅病毒小鼠模型
  19.1  引言
  19.2  材料
    19.2.1  新生小鼠的脑内感染
    19.2.2  3周龄到成年小鼠鼻内接种感染CHIKV
    19.2.3  新生小鼠的皮下接种
    19.2.4  14天到成年C57BL/6小鼠的足部皮下接种感染
  19.3  方法
    19.3.1  新生小鼠的脑内感染
    19.3.2  CHIKV鼻内感染3周龄到成年小鼠
    19.3.3  CHIKV皮下接种新生小鼠
    19.3.4  后肢皮下感染2周龄至成年C57BL/6小鼠
  19.4  注释
  参考文献
第二十章  使用ClonaCell-HY杂交瘤克隆试剂盒制备基孔肯雅病毒小鼠特异性单克隆抗体
  20.1  引言
  20.2  材料
    20.2.1  生物材料?细胞培养基和试剂
    20.2.2  其余设备和物品
  20.3  方法
    20.3.1  用基孔肯雅病毒免疫接种小鼠
    20.3.2  SP2/0骨髓瘤细胞制备
    20.3.3  小鼠脾细胞制备
    20.3.4  融合
    20.3.5  融合细胞接种培养皿
    20.3.6  挑选克隆
    20.3.7  克隆和亚克隆筛选
  20.4  注释
  参考文献
第二十一章  免疫组化检测福尔马林固定和石蜡包埋组织中基孔肯雅病毒抗原
  21.1  引言
  21.2  材料
    21.2.1  石蜡切片
    21.2.2  免疫组化
  21.3  方法
    21.3.1  石蜡切片
    21.3.2  免疫组化
  21.4  注释
  参考文献
第四部分 抗病毒药物和疫苗
第二十二章  抗基孔肯雅病毒的抗病毒策略
  22.1  引言
  22.2  治疗CHIKV感染的抗病毒策略
    22.2.1  病毒侵入抑制剂
    22.2.2  病毒蛋白翻译抑制剂
    22.2.3  病毒基因组复制抑制剂
    22.2.4  CHIKV nsP2抑制剂
    22.2.5  宿主靶点抑制剂
    22.2.6  未知靶点的抑制剂
  22.3  结论
  参考文献
第二十三章  实时细胞分析鉴定基孔肯雅病毒的新型抗病毒化合物
  23.1  引言
  23.2  材料
    23.2.1  组织培养
    23.2.2  细胞
    23.2.3  病毒
    23.2.4  抗病毒化合物
    23.2.5  RTCA组件
  23.3  方法
    23.3.1  细胞增殖分析
    23.3.2  细胞毒性试验
    23.3.3  抗病毒试验
  23.4  注释
  参考文献
第二十四章  双顺反子杆状病毒表达载体系统筛选干扰基孔肯雅病毒感染的化合物
  24.1  引言
  24.2  材料
    24.2.1  昆虫细胞培养
    24.2.2  重组杆状病毒产生与纯化
    24.2.3  昆虫细胞融合抑制试验
    24.2.4  化合物体外抗CHIKV活性测定
  24.3  方法
    24.3.1  昆虫细胞培养
    24.3.2  在Sf21细胞中产生重组杆状病毒
    24.3.3  重组杆状病毒的纯化
    24.3.4  昆虫细胞融合抑制试验
    24.3.5  体外抗CHIKV活性测定
  24.4  注释
  参考文献
第二十五章  基孔肯雅病毒感染中和试验:蚀斑减少中和试验
  25.1  引言
  25.2  材料
  25.3  方法
    25.3.1  在12孔板准备细胞单层
    25.3.2  CHIKV-抗体免疫复合物的制备
    25.3.3  感染检测
    25.3.4  蚀斑可视化
    25.3.5  蚀斑减少中和效价的测定
    25.3.6  微量中和试验
  25.4  注释
  参考文献
第二十六章  CHIKV反向遗传学研究方法
  26.1  引言
  26.2  材料
    26.2.1  病毒RNA提取
    26.2.2  反转录
    26.2.3  PCR扩增
    26.2.4  琼脂糖凝胶电泳和胶回收
    26.2.5  DNA克隆
    26.2.6  RNA转录与加帽
    26.2.7  克隆衍生CHIKV复制与扩增
    26.2.8  定点突变
  26.3  方法
    26.3.1  病毒RNA提取与cDNA合成
    26.3.2  PCR扩增病毒cDNA片段
    26.3.3  将病毒cDNA克隆至质粒载体
    26.3.4  CHIKV RNA转录本合成
    26.3.5  通过RNA转染获得感染性克隆来源的CHIKV
    26.3.6  克隆来源的CHIKV扩增与特性研究
    26.3.7  通过定点突变技术将突变引入全长cDNA克隆
  26.4  注释
  参考文献
第二十七章  在昆虫细胞中制备基孔肯雅病毒样颗粒和亚单位疫苗
  27.1  引言
  27.2  材料
    27.2.1  细胞培养
    27.2.2  重组杆状病毒Ac-sE1?Ac-sE2和Ac-S27制备
    27.2.3  CHIKV-sE1和-sE2糖蛋白亚单位及VLP制备
    27.2.4  CHIKV-sE1和-sE2糖蛋白亚单位纯化
    27.2.5  CHIKV-VLP纯化
    27.2.6  CHIKV糖蛋白分析
  27.3  方法
    27.3.1  细胞培养
    27.3.2  重组杆状病毒Ac-sE1?Ac-sE2和Ac-S27制备
    27.3.3  CHIKV-sE1和-sE2亚单位及VLP制备
    27.3.4  sE1和sE2亚单位纯化
    27.3.5  CHIKV-VLP纯化
    27.3.6  CHIKV蛋白分析
  27.4  注释
  参考文献
第二十八章  基孔肯雅病毒DNA新型疫苗的研发程序
  28.1  引言
  28.2  材料
    28.2.1  体外转染
    28.2.2  SDS-PAGE和Western blotting
    28.2.3  免疫荧光分析
    28.2.4  DNA疫苗免疫小鼠
    28.2.5  免疫小鼠脾细胞分离
    28.2.6  IFN-γ酶联免疫斑点试验
    28.2.7  酶联免疫吸附试验(ELISA)
    28.2.8  流式细胞术和细胞内细胞因子染色试验
    28.2.9  病毒中和试验
    28.2.10  猕猴DNA质粒免疫研究
  28.3  方法
  28.3  DNA疫苗设计
  28.3  体外转染
  28.3  SDS-PAGE和 Western blotting
  28.3  免疫荧光分析(IFA)
  28.3  DNA疫苗免疫小鼠
  28.3  免疫小鼠脾细胞分离
  28.3  IFN-γ酶联免疫斑点试验
  28.3  ELISA结合实验
  28.3  流式细胞术(FACS)和细胞内细胞因子染色(ICS)分析
  28.3  病毒中和试验
  28.3  恒河猴DNA质粒免疫研究
  28.4  注释
  参考文献